Fue el primero de sus matrimonios, y tuvo lugar con su prima María Manuela de Portugal, princesa de Asturias e infanta de Portugal, perteneciente a la casa de Avís. Nació en Coimbra el 15 de octubre de 1527. Era hija de Juan III, rey de Portugal, y de Catalina de Austria, y hermana de Carlos I de España.

El Rey eligió a esta joven como prometida para su hijo Felipe deseando reforzar la alianza con Portugal y, de esta manera, hacer del país vecino un aliado seguro en las guerras con el norte de Europa. Aparte de que el príncipe Felipe tenía ganas de casarse con María, hay que tener en cuenta que Juan III había prometido dotar a su hija con 300.000 ducados, por lo que esto fue considerado como interesante por Carlos I.

María de Portugal llegó a Salamanca, y la recibieron a la puerta de la ciudad con música y danzas y hubo escaramuzas entre escuadrones de soldados. Salieron a acogerla miembros de la clerecía, de la Universidad y de las Escuelas Mayores.

Curiosamente el príncipe Felipe acompañó a la princesa hasta Salamanca sin ser visto, y entró en la ciudad sin recibimiento por petición suya. El joven novio, curioso de saber cómo era su novia pidió que le enviasen unos retratos. Pero no contento con esto y con las descripciones que le mandó el embajador, don Luis Sarmiento por carta, don Felipe salió a escondidas con su cortejo a ver a la princesa. Según Manuel Fernández Álvarez, no sólo es curiosidad lo que mueve a nuestro príncipe a ir a ver a la princesa por el camino, sino que era también cuestión de protocolo, por eso se hizo acompañar para tener testigos de que tenía interés por su futura esposa.

El día cuando tuvo que encontrarse oficialmente con María, el príncipe se adelantó y perfectamente disfrazado se asomó a un balcón de la casa del doctor Olivares para ver una vez más a la infanta. Ésta lo supo, y al pasar por delante del precitado balcón, con cierta decorosa coquetería se cubrió el rostro con el abanico de ricas plumas que llevaba en la mano. Como los bufones tenían para todo libertad, el del conde de Benavente, llamado Periquito de Santervés, que era muy célebre entre los de su clase y acompañaba a la infanta para distraerla con sus gracias, comprendiendo lo que pasaba, apartó el abanico y descubrió plenamente el rostro de la infanta, acompañando la atrevida acción con muy oportunas palabras.

La misa de velaciones se celebró el 13, 14 ó 15 de noviembre 1543 en el palacio de los Solís en la actual plaza de los Bandos, recibiendo los novios la bendición del arzobispo de Toledo, Juan Pardo de Tavera. Ofició por la misa el cardenal-infante don Enrique, tío de la novia. Fue don Luis Sarmiento de Mendoza que figuró como apoderado del novio.

Al amanecer hubo un “Te Deum” en la iglesia de Santo Tomé, las celebraciones duraron cinco días y en ellas participó toda la ciudad que había construido arcos de triunfo para recibir a los novios.

En ese momento, tanto Felipe como María Manuela tenían 16 años. El primer y único hijo de esta unión, Carlos, nació el 8 de julio de 1545, cuatro días antes de que falleciera la Princesa, por lo que este matrimonio sólo duró dos años. En el año 1574, los restos de María Manuela fueron trasladados desde Granada al Panteón de los Infantes de la Cripta Real del Monasterio de El Escorial, donde continúan en la actualidad.

Finalmente el príncipe Carlos, sucesor al trono, falleció a los 23 años sin llegar a reinar.